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激光共聚焦顯微鏡的應用以及操作步驟介紹

發布時間:2021-12-28      點擊次數:1667
激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源,在傳統光學顯微鏡基礎上采用共軛聚焦原理和裝置,并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統。主要包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊(包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器)、數字信號處理器、計算機以及圖象輸出設備等。
 
主要用于組織切片、活細胞的熒光標記、三維圖像重建分析研究;細胞生物物質、離子的定性、定量、定時和定位分布檢測等;多重熒光觀察;長時間活細胞觀察;對材料進行反射光直接觀察和共聚焦成像掃描,可對顯微圖像進行普通熒光和DIC成像記錄和分析。
 
激光共聚焦顯微鏡操作步驟:
 
1.根據熒光探針的激發和發射波長選擇合適的激光,激光功率,光譜濾光片和發射濾光片。
 
2.確定掃描方法:點,線,面,3D掃描。
 
3.確定掃描密度(分辨率):256×256,512×512,1024×1024,2048×2048,分辨率越高,掃描速度越慢,圖像信噪比越好,但越多可能會發生光漂白。
 
4.選擇共焦顯微鏡物鏡的倍數和電子放大倍率:確定此條件后,確定掃描范圍,物鏡的透光率與數值孔徑(NA)的四次方成正比,并且物鏡放大倍數的平方。因此,反比例,應盡可能選擇具有高數值孔徑的物鏡。
 
5.根據樣品的制備質量,選擇合適的針孔尺寸,調節激光管電壓,光電倍增管功率,降噪等,達到最佳狀態。這些參數的選擇或設置非常緊密,應該全面考慮。
 
6.確定光線切割范圍,即掃描樣品的厚度,起始位置和結束位置。
 
7.給出了由光切割的層數和拍攝時的累積平均次數。
 
8.獲取圖像并保存。
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